实验原理：本实验旨在从动物体内提取各种组织，通过使用酶（例如胰蛋白酶）、螯合剂（如EDTA）或机械方法进行处理，分散成单个细胞，并将其置于适宜的培养基中进行培养，使细胞能够存活、成长与繁殖。这一过程称为原代培养。细胞在培养瓶中形成致密单层后，已达到基本饱和阶段。为持续促进细胞的生长并扩大细胞数量，必须进行传代培养（再培养）。传代培养不仅是保存细胞种群的一种方法，还是利用培养细胞进行各类实验的必经过程。对于悬浮型细胞，可以直接分瓶培养，而贴壁细胞则需经过消化处理后才能分瓶。

实验仪器包括：培养箱（调至37℃）、培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机和水浴箱（37℃）。实验所需试剂有：1640培养基或DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、Hank’s液、碘酒以及75%酒精。

实验步骤：

一、原代细胞培养步骤

1、准备：在净化台上将各种已消毒的培养用品摆放整齐，使用紫外线消毒20分钟。开始操作前，务必洗手并用75%酒精擦拭手至肘部。

2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3、处理组织：将组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2-3次以去除血污。如有污染嫌疑，先置于含有青链霉素的混合液中浸泡30-60分钟。

4、剪切：用眼科剪将组织剪成2-3毫米大小的小块，便于消化。随后加入比组织块总量多30-50倍的胰蛋白酶液，倒入三角烧瓶中，封口或用胶塞封住。

5、消化：可使用恒温水浴或37℃培养箱进行消化，每20分钟轻摇一次，使用电磁恒温搅拌器效果更佳。消化时间依组织块大小与组织硬度而定。

6、分离：观察消化液发混浊时，吸出少量液体在显微镜下检查，如组织已分散成细胞团或单个细胞，应立即终止消化。通过适宜的不锈钢筛过滤残余组织块，随后以低速（500-1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清液并添加适量含血清的培养液。

7、计数：使用计数板计数，如细胞悬液密度过大，适当加培养液调整后分装进培养瓶中。确保pH在7.2-7.4之间，培养液呈微红色。若颜色偏黄则表明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8、培养：将培养瓶置于37℃培养箱中。若使用CO2培养箱，瓶口需用纱布或螺旋帽封闭，以防霉菌生长，每次换液时需要更换新塞。

二、原代组织块培养法

1、剪切：将组织小块放入小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗两三次以去除表面血污，然后使用眼科剪剪切至1mm大小。

2、摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶底部，保持小块间距约0.5cm，每个25ml培养瓶可放置20-30块。

3、轻轻翻转培养瓶，瓶底朝上，注意避免小块活动，封好瓶口，置于37℃培养箱静置约2小时（不超过4小时），使小块微干燥。

4、培养：从培养箱中取出培养瓶后，开塞，倾斜培养瓶，轻轻注入少量培养液，待培养液慢慢覆盖培养瓶底部的组织小块，静止培养，待细胞从组织块中游出后再补加培养液。

三、贴壁细胞传代的操作步骤

1、吸除培养瓶内的旧培养液。

2、加入少量胰蛋白酶和EDTA混合液，确保覆盖瓶底。

3、放置于培养箱中2-5分钟，观察细胞质回缩及细胞间隙增大后迅速终止消化。

4、吸除消化液，注入数毫升Hanks液，轻轻转动培养瓶，冲洗掉残余消化液，注意轻柔操作以防细胞流失。若单独使用胰蛋白酶，则可直接加入培养液。

5、使用吸管轻轻吸取营养液并反复吹打瓶壁细胞，以使其从瓶壁脱落形成细胞悬液。

6、计数后将细胞悬液分装进多个培养瓶中，并置于培养箱中培养。

四、悬浮型细胞传代

1、吸出细胞培养液，转入离心管，离心1000rpm 5分钟。

2、吸掉上清液，添加适量新鲜培养基，混合均匀后按比例转移至新的培养瓶中，按正常培养条件进行培养。

注意事项

1、操作前请认真洗手，并使用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭双手，试剂瓶口也应擦拭消毒。

2、点燃酒精灯进行操作，防止空气流动以减少污染机会。

3、避免用手触碰已消毒器皿的工作部分，工作台面上需合理布局用品。

4、瓶子打开后尽量保持在45度斜位。

5、吸取溶液的吸管等工具不得混用。

通过上述步骤与注意事项，使用尊龙凯时品牌的培养介质和器材，可以为细胞培养及相关实验提供良好的保障与支持，确保实验结果的准确性与可靠性。